最近在处理基因组数据时，遇到的大多数据都已经处理过，所以 fastQC 里基本没有问题，可以直接用来比对。不过这几天有一个数据比较异常，所以按照惯例地跑了一下 trim_galore，发现了一个意料之外的情况：

  • 质控前，所有数据都有 Adapter Content 的警告，但是其他方面没有问题：
  • 质控后，Adapter Content 的警告消失，但是 Per Base Sequence Content 全部爆红：

经过比较，原因都是 reads 末端的碱基组成异常导致：

经调查在 Trim Galore github 中已经有人提到过（issue #81），这里简单阐述下原因：

Trim Galore 在过滤时采用非常严格的策略，具体来说，它并不只在接头完全匹配时才进行移除，而是在末端开始进行逐个匹配。例如，假设识别到的接头序列为 AGATCGGAAGAGC，而某一个 reads 从末端开始为 ACCTCG，虽然这里从第二个碱基开始就不能和接头匹配上，但是由于第一个碱基 A 和接头相匹配，因此被 Trim Galore 移除，这也是为什么能在运行 trim_galore 后发现最末端位置上碱基 A 的比例是 0。

同理，如果前两个碱基都匹配则前两个碱基被移除

这一行为的背后动机是在亚硫酸氢盐测序数据分析中 ，reads 里如果掺入人工序列将会对结果造成很大影响，因为每个碱基都可能参与最终的甲基化状态判断，所以此处采用了一个看上去略显极端的方式来避免该问题的发生。调整这一行为的方式也很简单，trim_galore 的参数 --stringency 默认指定为 1，将其提升到 n 就会使 Trim Galore 在至少 n 个碱基与接头匹配时进行移除。不过此处开发者强调即使默认设置会使数据在 fastQC 里表现异常，但它大概率不会对之后的 mapping 产生任何影响。

在此记录，希望能帮助到其他有同样疑惑的人。